制御ライン
Immunizingホスト動物で抗体 (s) から別の種二次生成することができ抗体。 たとえば、注入マウス抗体動物以外にマウス上げる抗マウス二次抗体。 ヤギ、ロバ、とウサギはほとんど使用されるホスト種製造するため二次抗体。
最も一般的なタイプの二次抗体はpooledに生成された人口のimmunoglobulinsからターゲット種。
たとえば、をimmunizingヤギ精製マウスigg生成ヤギ抗マウスigg抗体にバインドすべてクラス、ヘビーと軽鎖 (hl) と断片マウスiggならびに他の分子共有厳密され保存されドメイン (e。グラム。、igm共有同じカッパ軽鎖としてigg)。
対照的に、をimmunizingヤギとマウスだけIgG1抗体生成抗体に固有マウスIgG1抗体分子を共有厳密にされ保存されドメイン。
のための高度の保全に構造の多くimmunoglobulinドメイン、クラス固有二次抗体なければならない親和性を達成するために吸着精製とクロス最小限クロス反応他のimmunoglobulins。
固定化マウスIgG1抗体すべてヤギ抗体浄化することができことバインドマウスIgG1上記使用例。 を通過ガラスクロマトグラフィーカラム (s) マウスIgG2a、IgG2b、IgG3、igm、など、さらにだろうリファインこれら抗マウスIgG1抗体除去するためにクロス反応抗体とnon-IgG1 isotypes。
さらに、通過列含む固定化血清からタンパク質種以外に使用されているimmunizeさらに浄化することができ二次抗体。 この方法のクロス吸着 (多くに「高度クロス吸着 ") は、追加浄化ステップ推奨アプリケーション使用小学校から抗体複数種ときimmunoglobulinsまたは他の血清タンパク質probedサンプルに存在することができる。
制御ライン製品
Isotype制御
主な目的のisotype制御は決定のバインディング小学校抗体は特定の、ではなく非固有fc受容体または他の相互作用タンパク質。 また、バインド抗体競争力と実行と同様の機能機能ブロッキング抗体。
をisotype制御の主光源と一致して完全にする必要があり抗体、igタイピング、とラベルです。
正常な血清でネガティブコントロールとして使用することができimmunofluorescenceラベリング場合主抗体はpolyclonal。 原因にソースのfluorescentlyラベルmabs、unlabeled mabsから同じソースとして使用されるべきisotypeコントロールに調整背景染色。 たとえば: たとえば、一次場合抗体は抗ラットCD11bとクローン牛-42精製igg、そのisotypeはマウスIgG2a、ので精製マウスIgG2a isotype制御として使用することができまたはox-42。
Isotype制御: 同じimmunoglobulin subclassとしてmoabでunimmunizedマウス、などの要因携帯autofluorescence、fc受容体媒介抗体結合、と非固有抗体結合た主に考慮。 直接場合immunofluorescence染色使用され、isotype制御れるべきラベル蛍光顔料、igG1などfitc、IgG2a、pe、など。をまた、isotype制御とmoab-ラベルfluorochrome濃度とf: p比 (比のラベルにfluorochrome immunoglobulin分子) と同じ最高、 正確な設定のために不可欠である負と正携帯ランドマークの意味。 Isotype使用しない制御一致しないmoab、好ましくは製品によって準備同じ研究室や使用してプロセスまたは方法 (など同じブランド)。
Isotype制御フローcytometry
をfabフラグメントの抗体がバインド細胞表面低親和性と非特異性、特に携帯はデッドや細胞膜破損している。この非固有結合はより明白である。 したがって、isotypeコントロールでしばしば使用され実験決定背景蛍光レベル。
をisotype制御フローcytometryクラシック負参照であるために使用。 を達成するために同一断面-isotype間反応性制御と抗体、isotype、種、フルオレセイン、フルオレセイン、タンパク質比、濃度、と他の指標一致しなければならない。
注意事項:
1。抗原場合式は二峰性分布、と負と正ピーク分離されている、を実験結果は二峰性を理解することができます。
2。を場合養殖細胞検出する必要が、を設定しisotype制御この時間だけでいくつかの情報取得反映して携帯接着能力、とに困難でありその非固有蛍光反映情報を取得。 したがって、設定するisotype制御に検出養殖細胞理想的ではない。
3。フルオレセインのさまざまな場合同時にで実験で使用されて、中に分析、たが蛍光漏れは重要な影響結果、と背景蛍光はない明らかそれを設定するために適切ではないこの時間でisotype制御。 良い選択。 (Fmoコントロールは、細胞の同じ種、他のすべてで染色fluoresceins 1フルオレセインように除去漏れのさまざまなfluoresceinsにunlabeledチャネルは、顕在とゲート場所で配置することができ、だから、は必要なゲーティング用。 とfmo制御は重要な正と負の間を区別するために必須であるとき正確。 Fmo制御は今で使用される多色実験とは必要な多色用実験。)
4。を使用する場合isotype制御、たが非固有結合レベルは非常に高、にすることができる非固有のバインディングfcエンドに携帯、非特定の信号になり、に注意のでfc。
5。を理解する必要があるisotype制御は参考値助けるためにフィルターアウトいくつかの要因に影響実験、しかし、私たちは決定できません正と負カットオフポイントまたはセットゲートベースこの。 必要isotypeわかっていることを反映の背景蛍光非固有結合、と背景蛍光はまた他の要因による、autofluorescenceなど、高補償、抗体、ラベリング方法、楽器、他の試薬やデータ分析、および他の要因に影響背景蛍光。
6。titrateする必要があるターゲットを低減する抗体の背景蛍光非固有結合、isotype設定に適切な制御ではありません。 過度に抗体の量、負ピークシフトとベース拡大が発生します。
7。細胞シグナル伝達とサイトカイン場合は実験中で検出され、をfmo制御と負生物制御設定する必要があり、支払う特定unstimulatedに注意または細胞で処理phosphorylation阻害剤。
8.cell生存能力染料に追加され多色スキームに死細胞を除去。 ので非固有染色細胞の殺害は、極端な、ない場合除去、高いにつながる非固有結合に影響実験。
9.it利用可能にセット他のコントロールのほかにisotype制御さまざまな状況で。 たとえば、unstained細胞、決定負コントロール背景とautofluorescence、pmt設定電圧;
完全染色細胞、いくつか決定軸イベント、pmt設定電圧; のため染色細胞/microspheres、補償調整; unstimulatedまたは未処理サンプル、実験ネガティブコントロール; 正細胞 (刺激または処理特に薬) 、正実用的な制御。
